酵母雙雜交載體是將待研究的兩種蛋白質分別克隆(融合)到酵母表達質粒的轉錄激活因子(如GAL4等)的DNA結合結構域(DNA-BD)和轉錄激活域(AD)上，構建成融合表達載體，從表達產物分析兩種蛋白質相互作用的系統。
酵母雙雜交載體的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。
反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子 GAL4在結構上是組件式的(modular)，往往由兩個或兩個以上結構上可以分開，功能上相互獨立的結構域(domain)構成，其中有DNA結合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉錄激活結構域(activation domain，DNA-AD)。
這兩個結合域將它們分開時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的兩者通過適當的途徑在空間上較為接近時，才能重新呈現完整的GAL4轉錄因子活性，并可激活上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。
雙雜交系統的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。
80年代的工作表明， 轉錄激活因子在結構上是組件式的(modular)， 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有DNA結合結構域(DNA binding domain，簡稱為BD)和轉錄激活結構域(activation domain，簡稱為AD)，它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。
單獨的BD雖然能和啟動子結合，但是不能激活轉錄。而不同轉錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。
如酵母細胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉錄。
在酵母雙雜交系統中，"誘餌"蛋白X克隆至DNA-BD載體中，表達DNA-BD/X融合蛋白;待測試蛋白Y克隆至AD載體中，表達AD/Y融合蛋白。
一旦X與Y蛋白間有相互作用，則DNA-BD和AD也隨之被牽拉靠近，恢復行使功能，激活報告重組體中LacZ和HIS3基因的表達。