D-Luciferin Firefly, Free Acid D-螢火蟲熒光素（游離酸）

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D-熒光素（D-Luciferin）；Luc報告基因底物；螢火蟲熒光素酶Firefly luciferase；D-熒光素鉀鹽；D-熒光素鈉鹽；生物發(fā)光成像技術（Bioluminescence imaging，BLI）；Luminometer熒光計；CAS NO：2591-17-5；

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個生物技術領域，特別是體內(nèi)活體成像技術。作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當熒光素過量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉染進入細胞后，導入研究動物如大小鼠體內(nèi)，之后注入熒光素，通過生物發(fā)光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監(jiān)測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據(jù)生物發(fā)光強度的變化來指示能量或生命體征。

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。目前市場上有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產(chǎn)品主要差別在于溶解特性。D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內(nèi)的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。但鈉鹽和鉀鹽形式的D-熒光素能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內(nèi)實驗。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)應用上都沒有實質(zhì)性的差別。

基本特性：

1）  CAS NO：2591-17-5

2）  化學名：(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid; D-Luciferin Firefly, free acid D-螢火蟲熒光素游離酸，D-甲蟲熒光素游離酸；

3）  分子式：C11H8N2O3S2

4）  分子量：280.32 g/mol

5）  純度：＞99% (HPLC)

6）  外觀：類白色至淺黃色粉末

7）  溶解性：溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50mg/ml），溶于弱堿，微溶于水

8）  化學結構圖：

注意事項

1）螢火蟲熒光素（firefly luciferin）和甲蟲熒光素（beetle luciferin）皆相同化合物，即：(S)-2-(6-Hydroxy-2- benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylic acid，僅不同公司在命名上的差異。

2）螢火蟲熒光素（firefly luciferin）在保存和操作的過程中需要避光。另，水溶性儲存液經(jīng)過濾除菌后，可置于-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。若條件允許，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩(wěn)定性和保存時間更長，長達1年。

3）螢火蟲熒光素（firefly luciferin）的注射方式，以及動物類型、體重等都會影響熒光信號發(fā)射，建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定zuijia信號平臺期和zuijia檢測時間。

4）紫外線和潮氣會產(chǎn)生脫氫熒光素，是一種熒光素酶的競爭性抑制劑。因此需小心保存和處理D-熒光素。-20℃避光干燥保存。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

A．體外生物發(fā)光檢測

1. 儲存液制備

【注意】：建議大量實驗前先取少量原料（D-熒光素游離酸）溶于你的緩沖液，以測試其溶解性。

【配置方法】：要溶解螢火蟲熒光素游離酸到生理鹽中，首先用NaOH或KOH調(diào)整緩沖液到預測的摩爾堿度，然后加入D-熒光素游離酸（如15mg/ml），邊攪拌邊促進溶解。如果仍有沉淀，調(diào)整pH到更高直至*溶解。zui后用酸調(diào)整pH到所需值。混勻后立即使用或分裝于-80℃避光凍存，避免反復凍融。

2. 熒光素酶反應緩沖液制備

2.1 配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250µM CoA，150µM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻資料來調(diào)整。按照以上配方制備熒光素酶反應緩沖液（2×）。

3. 收集細胞裂解上清（熒光素酶表達）

根據(jù)需要檢測的細胞類型，選擇合適的裂解液進行細胞裂解，離心收集上清后續(xù)檢測待用。

4. 螢火蟲熒光信號檢測

【注①】：螢火蟲熒光信號的檢測方法大體上取決于冷光測定儀（luminometer）類型（是手動型熒光計、單管注射型或者酶標板讀數(shù)型熒光計）。根據(jù)特定發(fā)光測定儀，來考慮注射用量和程序設置。

【注②】：需設置不含熒光素酶的孔（用作陰性對照），以測定背景熒光。

例：注射式冷光測定儀（injectible luminometer，單樣或微孔板，200µl終體積）

a）吸取100µl熒光素酶反應緩沖液（2×）到一干凈的冷光測定儀比色皿或96孔板的各孔（使用全白平底的96孔板）；

b）吸取50~98µl裂解上清到皿或孔內(nèi)；

c）如果有需要，用水來補足使得總體積到198µl；

d）設置程序注射2µl熒光素儲存液（使工作濃度150µg/ml），程序：2~5秒延遲（delay），之后10s測定。

B．活體成像分析

1）工作液準備：準備少量的PBS（w/o Mg2+）, pH=12以及PBS（w/o Mg2+）, pH=2緩沖液。先取10mg D-熒光素游離酸到165ml PBS（w/o Mg2+）, pH=12，充分溶解后，再加入165ml PBS（w/o Mg2+）, pH=2中和溶液，混勻得到30mg/ml的工作液。0.2µm濾膜過濾除菌。混勻后立即使用或分裝于-80℃避光凍存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2）注射方式：適用于靜脈注射，腹腔注射，肌肉注射和鼻內(nèi)注射等，根據(jù)具體方式調(diào)整注射體積，zui常用的注射濃度為150mg/kg體重。

3）檢測方式：注射入體內(nèi)10-20 min（待光信號達到zui強穩(wěn)定平臺期），再進行成像分析。

【注意】：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定zui高信號檢測時間和信號平臺期。

相關產(chǎn)品：

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】 

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D-Luciferin Firefly Free Acid D-熒光素游離酸 熒光探針與細胞染色

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