Probes for reactive oxygen species（活性氧ROS探針）技術專題
Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素
Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素
專題關鍵詞：
Aminophenyl fluorescein (APF)；Hydroxyphenyl fluorescein (HPF)；Reactive oxygen species (ROS) 活性氧物質；DCFH-DA；CAS：359010-69-8；
基本描述：
氨基苯基熒光素（APF）和羥苯基熒光素（HPF）是由T. Nagano開發(fā)的兩種活性氧（Reactive oxygen species, ROS）指示劑，比H2DCFDA（DCFH-DA, DCFH）具更的特異性和穩(wěn)定性。APF和HPF顯示有限的非選擇性反應，和相對較高的光誘導氧化抗性。APF和HPF具細胞膜滲透性，本身無熒光，直到與羥基自由基或過氧亞硝基陰離子反應，還能與次氯酸陰離子反應，產生強綠色熒光（Ex/Em，~490/515nm），可用熒光顯微鏡、高通量成像儀、熒光酶標板或流式細胞儀檢測。
工作原理：
中性溶液中氨基苯基熒光素（APF）和羥苯基熒光素（HPF）幾乎是無熒光，當與高活性氧物質（highly reactive oxygen species, hROS）反應，能夠生成具有高熒光強度的熒光素（Ex/Em, 490/515nm），且能觀察到熒光強度的增加【見下反應原理圖】。
探針特征：
□ APF，HPF選擇性檢測hROS比如羥基自由基（HO•）和過氧亞硝基陰離子（ONOO–），但不會與其他活性氧物質反應（•O2–,1O2, H2O2, NO等）；
□ 通過加入辣根過氧化物酶（HRP）能定量測定過氧化氫H2O2;
□ 結合使用HPF和APF能特異性檢測次氯酸（OCl-）;
□ HPF和APF本身根本不會自氧化，從而與其他試劑相比能得到更可靠的數(shù)據(jù)；
□ 能對活細胞進行成像檢測；
ROS探針檢測特異性比較：
□ 試劑配制：1mg HPF/APF分別溶于DMF配制成5mM儲存液。使用前用磷酸鹽溶液（0.1M, pH 7.4）稀釋500~5000倍（10～1μM）。將稀釋液加入樣本并孵育，然后測定熒光值（Ex/Em, 490/515nm）。
□ 磷酸鹽緩沖液體系（0.1M, pH 7.4），每一種熒光試劑（終濃度：10mM，0.1% DMF用作共溶劑）與各種活性氧物質反應。
□ HPF（Ex/Em=490/515nm）, APF（Ex/Em=490/515nm）, DCFH（Ex/Em=500/520nm）的熒光強度測定。
表1. 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對各種活性氧物質的反應特異性
ROS | HPF (MX4805-1MG) | APF (MX4804-1MG) | DCFH (MX4802-50MG) |
HO• | 730 | 1200 | 7400 |
ONOO– | 120 | 560 | 6600 |
OCl- | 6 | 3600 | 86 |
1O2 | 5 | 9 | 26 |
•O2– | 8 | 6 | 67 |
H2O2 | 2 | ＜1 | 190 |
NO | 6 | ＜1 | 150 |
ROO• | 17 | 2 | 710 |
Autoxidation | ＜1 | ＜1 | 2000 |
ROS探針應用示例：
示例1：細胞經光誘導的自氧化檢測（Light-induced autoxidation in cells）
1.1 探針加量：37℃避光孵育細胞30min，HPF或DCFH-DA（10mM each）
1.2 熒光測定：共聚焦顯微鏡觀察熒光（激發(fā)波長488nm，檢測波長＞515nm）；488nm波長輻射刺激細胞10s，然后再測定熒光。
1.3 實驗圖片：
示例2：豬中性粒細胞的體內成像（Bioimaging of porcine neutrophils）
2.1 豬中性粒細胞的純化
a）從豬血中純化中性粒細胞；b）將純化的中性粒細胞溶于KRPD緩沖液（Krebs-Ringer phosphate buffer）(114 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 2.4 mM MgSO4, 1.0 mM CaCl2, 15 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)，置于冰上直至使用。將其轉移到培養(yǎng)皿內。
2.2 探針加載與PMA刺激
a）加10mM HPF或APF到細胞，室溫孵育30min。b）加入佛波酯PMA（2ng/ml）刺激中性粒細胞；
2.3 中性粒細胞的體內成像
刺激前或刺激后10min用共聚焦顯微鏡觀察中性粒細胞（激發(fā)波長488nm，觀察波長505nm-550nm）。
產品信息：高品質產品，現(xiàn)貨供應，咨詢，maokangbio內容。
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 價格（元） |
MX4804-1MG | Aminophenyl fluorescein (APF) 氨基苯基熒光素 | 1mg | 2080 |
MX4805-1MG | Hydroxyphenyl fluorescein (HPF) 羥苯基熒光素 | 1mg | 2080 |
MX4802-50MG | H2DCFDA (DCFH-DA, DCFH) 活性氧（ROS）熒光探針 | 50mg | 546 |
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相關產品：ROS研究常用的配套產品，需要了解更多信息咨詢，maokangbio內容。
貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 價格（元） |
MX4801-1KIT | Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）檢測試劑盒 | 100~500T | 328 |
MZ2401-100UL | PMA (TPA, 5mg/ml)佛波肉荳蔻醋酸（5mg/ml） | 100μl | 280 |
MS5603-50ML | tert-Butyl hydroperoxide solution (TBHP) 叔丁基過氧化氫溶液 | 50ml | 98 |
MP5429-10MG | N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) N-甲酰-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸 | 10mg | 588 |
M36008（Invitrogen） | MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | 50 µg | 650 |
注意事項
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
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